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用PCR技术检测犬的结核病

2020-08-10 17:54
细菌培养,涂片检查及用PCR对病犬检测结果表明,用琼脂糖凝胶电泳,经溴化已锭染色检测临床样品PCR扩增的DNA。对病犬做了尸体剖检和治体组织检查,对所采取的样品进行了组织病理学、细菌培养、槐黄染色和PRC检测。用两对寡核苷酸引物进行PRC扩增来检测提取的DNA样品。4用根对IS6110插入片段和MPB70基因的引物作PCR已证实细菌培养为阳性的犬(1号)患结核分枝杆菌复合症。通过PCR技术扩增分枝

细菌培养,涂片检查及用PCR对病犬检测结果表明,用琼脂糖凝胶电泳,经溴化已锭染色检测临床样品PCR扩增的DNA。对病犬做了尸体剖检和治体组织检查,对所采取的样品进行了组织病理学、细菌培养、槐黄染色和PRC检测。用两对寡核苷酸引物进行PRC扩增来检测提取的DNA样品。4用根对IS6110插入片段和MPB70基因的引物作PCR已证实细菌培养为阳性的犬(1号)患结核分枝杆菌复合症。通过PCR技术扩增分枝杆菌IS6110和MPB70双链DNA,并用地高辛配体---N ----duPT标记制成探针。将PCR检测的结果与组织病理学和传统培养法进行对照。


  结核分枝杆菌可引起犬肺、胃肠道或传布性疾病。由于与患结核病的人或六畜交兵较多,犬可能传布结核病。传布旅途主要是呼吸道、消化道或交兵习染。犬对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌一样敏锐,但在乡下大部分犬被结核分枝杆菌习染或由于带菌患者交兵而勉励此病。犬最习见的习染部位是支气管淋巴结和肺。

虽然对害病的犬用适量异烟肼和链霉素进行休养,但还没有药物休养有效的报道。被习染的犬通常有大开的病灶,有习染的分枝杆菌通过唾沫、尿液或粪便倾轧体外、并对人构成劫持。该病犬在早期和中期通常无症状,甚至活动性和有大开性病灶的犬也能万世无症状。因此,对病犬早期诊断很停滞。犬的肉眼病灶易同化,类似于赘瘤病灶而不是典范的结核结节。不同诊断应包含真菌性肺炎和寄生虫性肺炎。组织病理学反省和作育不同此菌,对诊断起决定习染,但作育和决断本菌时间太长。

本举行用DNA扩增的主张检测,从治体或剖检犬包含的组织典型中结核分枝杆菌复合症的病原。将PCR检测的结果与组织病理学和古代作育法进行对比。

原料和主张

包含4只可疑结核病的犬,主要临床症状为食欲减退、吐逆、体重减轻,间歇热、嗜唾、呼吸停滞、淋巴结肿大。两位主人有结核病史。对病犬做了尸体剖检和治体组织反省,对所采取的典型进行了组织病理学、细菌作育、槐黄染色和PRC检测。

组织病理学反省:将典型用100%的福尔马林缓冲缓液固定,白腊包埋,制成4am厚的切片,然后用苏木精和曙红染色。

细菌学反省:将组织典型中分,1份贮存于零下80摄氏度前提下,以备一再侦察。另一份取5g带病灶的典型切成小块,加无菌蒸馏水用匀浆机(IUC)刑罚15分钟使之匀质。然后取2ml匀浆用Tacquet和Tison(1991)的主张去污,并取10ml匀浆加入加入10m10.75%氯化脱环已基吡啶(hexadecylpyridinium chlorid)进行去污,将同化物在Sigma3—10 离心机心1068转速离心30分钟,沉没,接种于Coletsos 和无甘油的Lowenstin 两种作育基,每周仰慕其产生情况,对疑似分枝菌菌落用萋一纳氏技术反省嗜酸菌,对不同菌按其事势个性及生化个性来决断,还用Accuprobve 探针(基因探针检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)。

涂片反省;参考(1976)的主张将作育物用槐黄酚盐粉色制成涂片,用400倍荧光显微镜反省此片。

DNA索取:用 litbana 等(1995)刻画的主张列解细菌索取DNA,行将去污的典型加热灭活、离心,沉没用100al蛋白酶K(0.1mg/ml)液重于56摄氏度1小时,再煮沸5分钟,用20000离心机离心5分钟,将上清液用 纯化一律处理,索取DNA。

DNA扩增:用两对寡核苷酸引物进行PRC扩增来检测索取的DNA典型。第一对引物IS43(5’TcA Gcc GcG Tcc AcG ccG ccA3’)和IS41(5’CCT GCC AGC GTA GGC GTC GG3’)分别与IS6100插入成份的568至588和884至865的碱基配对。第二对引物TBIF(5‘GAA CAA TCC GGA GTT GAC AA3’)和TBIR(5’AGC ACG CTG TCA AGC ATG TA3’)和TBIP(5’AGC ACG CTG TCA AGC ATG TA3’)对MPB70基因的276至295和647至628的碱基配对。两个反应用PIC—100举措控温仪在典型前提下进行,每个反应加50ngIS41、50ngIS43及20ngTBTIF、20ngTBIR寡核苷酸退火温度分别为68摄氏度、60摄氏度。扩增的DNA主段巨细分别为317bp(IS110) 372bpCMpB70基因),用2%的琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭(0.5ag/ml)染色检测扩增结果。每组举行包含阳性和阴性对比。

用Mutu—GeneR体外诱变试剂盒(BIO—RNA )来定点诱变寡核苷酸构建重组质粒。对比质粒PPG10,含有IS41和IS43反义链寡核苷酸序列,且被1250碱基分开,这一质粒通常被用作IS6110PCR扩增时对比。

Southem痕迹杂交;通常用于检测PCR产品的特异性。电泳之后,被扩增的DNA通过Southem痕迹被厘革到带正电荷尼龙薄膜上,这一历程用785真空痕迹安置(BIORAD)可变真空泵在40mbar于0.4N氢氧化钠溶液中进行。将薄膜在2xssc中浸泡(0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠),经气氛干枯,以120摄氏度20—30分钟加热固定DNA。

通过PCR技术扩增分枝杆菌IS6110和MPB70双链DNA,并用地高辛配体---N ----duPT信号制成探针。寡核苷酸IMS1(5’GCT GAG GGC ATG GAG GTG GC3’) INS2(5’GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA3’)及TBIF和TBIR分别用于纯牛分枝杆菌染色体AH5DNA 245bp和372bp片断的扩增。该反应在地高辛配体—11—duPT加入DNTPS同化比例为1:3的前提下进行。PCR产品用Nugic Miniprips(Promega)纯化。

将薄膜用5乘以SSC,0.1%的N一十二烷基肌氨酸,0.02% 的十二烷基磺酸钠及0.1%的阴断抑制剂在42摄氏度下温育过液。杂交后的薄膜 在室温下用2XSSC,0.1%十二烷基磺酸钠倾耳细听涤2次,一再5分钟,之后用0.5乘以SSC,0.1%的十二烷基磺酸钠在42摄氏度冲洗2次,一再15分钟。

此高辛配体检测法:现在制造厂举荐用碱性磷性磷酸酶信号抗体DNA检测试剂盒以及氨蓝四唑和X—磷酸酶比色检测地高辛配体信号探针记探针的存在,产生印象影印到乙酸幻灯片上(3M)并被拍摄下来。

结果

1一只犬(1号)患有粟粒状的结核,胸、腹部器官广泛弥漫性结节,有严重的干酪样变和钙化,皮肤可见痿孔伤害。

2眼观及组织病理学反省,可见犬的结核病变。

3从可疑患结核病的一只犬(1号)作育不同到结核分枝杆菌。

4用根对IS6110插入片断和MPB70基因的引物作PCR已凭单细菌作育为阳性的犬(1号)患结核分枝杆菌复合症。另外3只犬的样口细菌作育为阴性,PCR检测结果也为阴性。阴性对比争执了典型DNA被习染的可能,内中对比质粒也未出现假阴性结果。

细菌作育,涂片反省及用PCR对病犬检测结果表明,用琼脂糖凝胶电泳,经溴化已锭染色检测临床典型PCR扩增的DNA。IS6110和MPBA70探针及Southem痕迹分要,凭单了从1号狗索取的DNA经PCR扩增产品的特异性。

由于结核病在发病和匿伏上的特点,对人类已构成了劫持。但犬的结核病没有引起人们的丰厚亲切。引外,犬的结核病又作为人的结核的元首,因为犬病可能是由人习染的。如1号犬在体现出任何临床症状之前,其主人被确诊为结核病。同时也凭单PCR是检测犬结核的凿凿而有效的主张。


结核分枝杆菌有牛型、人型和禽型3型。结核病犬常缺乏明显的临床表现和特征性的症状,只是逐渐消瘦,体躯衰弱,易疲劳、咳嗽(干咳或有脓痰),食欲明显降低。结核病灶扩大蔓延时,还可发生多发性结核性支气管炎和支气管周围肺炎,支气管周围被结核性肉芽组织呈袖套状包围。试验时,可用提纯结核菌素,于大腿内侧或肩胛上部皮内注射o.1毫升,经48~72小时后,结核病犬注射部位可发生明显肿胀,其中央常坏死(阳性反应)。皮肤结核可发生皮肤溃疡。肠粘膜上的结核病灶为带堤状边缘的溃疡 (3)结核菌素试验。扁桃体和上颌淋巴结也经常发生结核病变,甚至融化而突破皮肤,形成瘘管。[防治措施] 第一,种犬繁殖场及家庭养玩赏犬,应定期进行结核病检疫。


2.运输笼 。1.捕捉夹 。二、饲料加工设备 。图1-11竹鼠捕捉夹 。四、产品加工设备 。因而运输笼具须为金属结构,批量运输1付,可事先用14号线的镀锌焊接网制作运输笼,其规格为90厘米x60厘米x25厘米,每只运输笼可装人1-2千克重的竹鼠8-10只。(2)分层铁网笼 如果在原地合群不好,为有效地防止竹鼠咬架,可采用钢筋焊接,铁丝网或眼子铁皮做成双层运输铁笼,其规格为60厘米x23厘米x23厘米,分上下两层.每层用薄铁皮分隔成5小笼,规格为12.5厘米x 115厘米x 11.5厘米,每小笼装1只竹鼠,可共装10只。


鳄龟大家都不陌生吧,但是在饲养方面的话,很多人都很陌生了,很多人在样鳄龟方面都不注意,从而导致鳄龟的死亡也是在所难免的。鳄龟的冬眠问题。鳄鱼龟养殖技术,鳄鱼龟是目前很热门的一种宠物龟,深受大家的喜欢。水温在1摄氏度以上,鳄龟就能正常过度,在12摄氏度以上时就可以进入浅眠的状态,而当环境温度达到6摄氏度时,鳄龟就可以进入深度的冬眠。除了换水,尽量不要打搅龟。而在喂养鳄鱼龟的时候,配合饲料投喂量一般为鳄鱼龟总体重的1.5%-2.5%,鲜活饲料的5%-10%。鳄龟一般较少患病,但在高密度养殖条件下易患消化不良症,可对病龟 填喂含多酶片的药饵(每公斤龟用药2片)。因此务必使养龟水温维持在 30℃~31℃内。


预防鱼类病害必须从控制和消灭病原着手,购进苗种放养前,对其进行药物浸洗消毒,切断病原随苗种进入池塘的途径。一般每年在种放养前要对池塘进行彻底的清整消毒,以消灭原池中病原生物。病原体往往黏附在饲料中进入池塘,因此投喂的饲料必须清洁、新鲜,最好经过消毒。病害易发季节定期泼洒药物全池消毒或定期投喂药饵,控制病原滋生繁衍,以达到防病效果。食场的残渣剩饵往往成为病原体的繁殖场所,因此要经常对食场进行药物消毒,以杀灭病原。(3)苗种放养前须药浴消毒。池塘养殪水体要有独立的进、排水管道,即各个池塘能独立地从进水渠道进水,并能独立地将池水排到排水沟里去,而不能从相邻池塘进水或将水排入相邻池塘。投饲技术,这。


利福平10-20毫克/千克体重·次,每天2~3次内服。第二,需要治疗的犬,应在隔离条件下,应用抗结药药物治疗,如异烟肼4~8毫克/千克体重·次,每天2~3次内服。肠系膜淋巴结发生结枝肿大明显时,可严重影响消化,犬的皮肤结核多发于喉头和颈部.病灶外观为边缘不整的肉芽组织状溃疡。结核分枝杆菌对外界环境的抵抗力很强.对干燥和湿冷的抵杭力较强,而对高温的抵杭力弱,60℃30分钟即可将其杀死。常用消毒药需经魂小时才ilJ将其杀死。肠枯膜上的结核病灶为带堤状边缘的溃疡。犬对结核分枝杆菌也比较易感染本病.结核分枝杆菌有牛型、人型和禽型3型。犬结核病,本病是由结核分枝杆菌所引起的多种家畜、家禽、野生动物及人的传染病。